INTRODUÇÃO

      A elaboração pelos alunos de mapas de restrição do DNA contribui decisivamente para a aprendizagem e compreensão de uma tecnologia muito importante no actual contexto da civilização humana: a “engenharia genética” (fig. 1).

Figura 1- Princípios fundamentais da “engenharia genética” (ou tecnologia da recombinação do DNA). As primeiras etapas na manipulação genética são o isolamento de um plasmídio bacteriano (1) e a purificação do DNA das células que contêm o gene de interesse (2). De seguida, esse gene é retirado do DNA por acção de uma enzima de restrição e inserido no plasmídio (“cortado” com a mesma enzima) [3]. O plasmídio recombinante é então introduzido nas células bacterianas (4), as quais adquirem uma capacidade metabólica nova devido ao gene introduzido. As bactérias são colocadas num meio de cultura apropriado para uma intensa reprodução mitótica (5). As bactérias transformadas (6a), ou uma proteína por elas produzidas   (codificada pelo gene introduzido) [6b], podem ser aplicadas em campos tão diversos como a agricultura, a gestão ambiental e a medicina.

Para a abordagem do tema “engenharia genética”, este sítio apresenta um exercício laboratorial e um conjunto de fotografias com os objectivos de estimular e facilitar a realização de uma experiência de digestão e mapeamento de DNA nas escolas secundárias que possuam equipamento de electroforese em gel.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

A sequência das bases adenina, timina, citosina e guanina no DNA constitui a informação genética dos seres vivos. Uma secção de DNA que contenha a informação necessária para a biossíntese de um polipéptido ou de uma proteína recebe o nome de gene. O genoma humano possui 60.000 a 80.000 genes distribuídos por 23 pares de cromossomas.

            O primeiro passo da manipulação do DNA, com o objectivo de o sequenciar ou de transferir um dado gene para um organismo (genoma) diferente, é o “corte” das macromoléculas núcleo-tídicas em porções mais pequenas. Para este fim os cientistas usam umas enzimas especiais, as endonucleases de restrição. Cada uma destas enzimas tem uma designação que deriva do nome científico da espécie bacteriana de onde é extraída, como é o caso da enzima EcoRI, a primeira (I) a ser isolada da estirpe R da bactéria Escherichia coli. Cada enzima de restrição reconhece uma sequência específica na molécula de DNA, “cortando” o material genético nessa região (tabela 1). Na Natureza, as enzimas de restrição são usadas pelas bactérias para reconhecer e destruir DNA estranho, como o dos vírus, constituindo assim um sistema imunitário primitivo.

Concluída a digestão do DNA por uma enzima de restrição, o passo seguinte é a separação dos diferentes fragmentos resultantes. Para tal, recorre-se usualmente à electroforese em gel de agarose (a agarose é uma substância que resulta da adição ao agar de um polissacárido linear, neutro, constituído por moléculas de galactose e 3,6-anidrogalactose) - figura 2.

Figura 2- Equipamento para a electroforese do DNA em gel de agarose.

Amostras das digestões com diferentes enzimas são colocadas em “poços” existentes no gel, imerso numa solução-tampão ao qual é aplicado um campo eléctrico; como as moléculas de DNA estão carregadas negativamente, os fragmentos movimentar-se-ão em direcção eléctrodo/pólo positivo e percorrerão na matriz gelatinosa uma distância que depende sobretudo das dimensões e forma respectivas (os fragmentos mais pequenos e compactos atravessam o gel mais facilmente).

        Para além dos fragmentos resultantes da digestão enzimática, cada “corrida” electroforética inclui moléculas de DNA com uma massa previamente conhecida, designadas padrões (ou marcadores) de massa molecular. Terminada a “corrida”, estes padrões terão percorrido no gel (a partir do “poço” onde foram colocados) uma distância em centímetros inversamente proporcional ao logaritmo decimal da dimensão em pares de bases, o que permite construir um gráfico a partir do qual são determinadas as dimensões dos fragmentos resultantes da digestão. [A dimensão de uma molécula de DNA pode ser expressa em termos do número de pares de bases azotadas. Por exemplo, o genoma da E. coli é constituído por cerca de 4.000.000 de pares de bases (pb), isto é, 4 Megabases (1 Mb = 10⁶ pb) ou 4.000 kilobases (1 kb = 10³ pb)]

Uma vez que cada enzima de restrição “corta” o material genético em locais específicos, o DNA de um determinado organismo pode ser diferenciado do de um outro ser vivo pelo número e pela localização dos “cortes” efectuados por essa enzima. Assim, pode ser elaborado para cada molécula de DNA um esquema com a localização dos pontos onde uma dada enzima de restrição hidrolisa a cadeia nucleotídica, ao qual é dada a designação mapa de restrição. Para a construção de um mapa de restrição relativo a duas endonucleases é necessário comparar o resultado electroforético da digestão realizada por cada enzima individualmente com o resultado da digestão dupla, a fim de ordenar correctamente os locais de restrição de cada enzima na molécula de DNA estudada.

A construção de um mapa deste tipo é útil para identificar e/ou diferenciar amostras de material genético provenientes de fontes desconhecidas, ou para determinar a ocorrência e a taxa de mutações ao longo de um certo período de tempo em organismos que têm genomas pequenos e se multiplicam rapidamente, como é o caso das bactérias. Tratando-se de seres humanos, com um genoma que possui milhares de genes e com uma grande variabilidade em determinadas regiões cromossómicas, a distribuição no gel dos fragmentos de restrição do DNA forma um padrão único para cada pessoa comparável ao código de barras utilizado no comércio; estas impressões de DNA, obtidas a partir de amostras de sangue ou de pele, podem ser usadas para a identificação de um dado indivíduo quando tal não é possível através de métodos mais convencionais (impressões digitais).

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